实验服务

实验委托服务
  绿藻公司可以帮助客户完善科研实验,满足客户提高科研能力的需求。现与国内多家知名的技术服务企业进行科研合作与交流。在整个实验流程上,专家配合客户监测实验流程,审查实验数据(QC),以提高实验效率,并确保试验结果的专业性,科学性。流程包括实验设计支持、试验流程监控、实验数据审查、实验结果分析。

Western blot

    实验原理
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
   
    实验步骤
提蛋白 跑胶 转膜  封闭    孵育   显色曝光
1.蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的溶剂。
细胞裂解液;0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+10μl泛酸钠+1μl pepstain
有机溶剂提取法
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁酮等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
注意事项:细胞数量达5×106个就可以做WB
将细胞裂解液再离心,收集上清液,加loading煮样5min,煮沸5-15min,以充分变性蛋白,保证蛋白从空间结构变为一级结构。有时也可以在70℃加热5-10min,尤其适用于多次跨膜蛋白的检测。
2.跑胶
试剂 10%分离胶组分(ml) 5%浓缩胶组分(ml)
ddH2O 2.8 1.4
30%聚丙烯酰胺 2.31 0.33
1.5M Tris 1.75 0.25
10% APS 0.07 0.02
SDS 0.07 0.02
TEMED 0.0028 0.002
Total 7 7
注:实验时,胶的浓度和配比跟可能有所不同
电泳:将胶夹好放于电泳槽中,加电泳buffer(内外面不得联通),将电压调到90V开始电泳,待marker开始分离时将电压调到120V,直到溴酚蓝前沿跑出胶后停止电泳。
注意事项:1.做胶 防止漏胶 进气泡以及花胶(水封 插梳子及拔梳子)
        2.加样:两边加loading,加样量一样,加样时间尽量短,以免样品扩散。
3.转膜
顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板
条件: 0.35A 250V  100min 冰浴中进行,具体时间根据目的蛋白大小而定
注意事项:1.转膜前将海绵 胶 膜都用预冷的转移buffer浸泡20min
          2.避免直接用手碰杂交膜,是用镊子。
3.保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样。
4.夹好膜和凝胶后,确定凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在。
5.如果选择鸡来源的抗体,最好使用硝酸纤维素膜(NC膜)
4.封闭:转膜后,用TBST洗3遍每次10 min,后浸没于封闭缓冲液 (含5%脱脂奶粉的TBST) 中室温摇床上缓慢摇荡1小时。
5.孵育:封闭后将膜用TBST洗3遍,每次洗5分钟。将不同分子量的塑料膜分别浸于配制好的一抗稀释缓冲液中,在平缓摇动的摇床上室温摇动1 h,4℃静置过夜。一抗孵育结束后,用TBST洗膜三次,每次5 min。加入二抗溶液,摇床上缓慢摇动,室温25min。  二抗孵育结束后,用TBST洗膜三次,每次5 min。
6.曝光显色