实验服务

实验委托服务
   绿藻公司可以帮助客户完善科研实验,满足客户提高科研能力的需求。现与国内多家知名的技术服务企业进行科研合作与交流。在整个实验流程上,专家配合客户监测实验流程,审查实验数据(QC),以提高实验效率,并确保试验结果的专业性,科学性。流程包括实验设计支持、试验流程监控、实验数据审查、实验结果分析。


核酸水平
总RNA提取(细胞)
提取细胞RNA的步骤:
1)  六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打。
2)  将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中,加入氯仿0.2ml/管,用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min,离心(4℃,12,000g,15min)。
3)  离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质),小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
4)  加入等体积异丙醇,0.4-0.5ml,混匀,15-30℃下孵育10-30min,离心(4℃,12,000g,10min)。其中如果加入等体积异丙醇后,置于试管架上用PE手套密封后,放于4℃冰箱中,沉淀30min效果更好。
5)  去上清,沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4℃,7,500g,5min)。
6)  小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清,尽量除去。
7)  加入20ul DEPC水溶解,分装5ul/管,-70℃冰箱保存。
8)  细胞总RNA的鉴定:0.9-1.2%琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA,观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定:分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。

总RNA提取(组织)

1、将组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml的Trizol液研磨;每2E6个细胞加入1mLTrizol.注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%.
2、研磨液室温放置5min,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,静置5min,12,000rpm离心5min.
3、取上层水相于一新的离心管,按每1ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,剧烈振摇使混匀,4℃,12,000rpm离心10min.
4、弃去上清液,按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入70%乙醇,涡旋混匀 ,4℃×7,500rpm×5min.
5、重复以上步骤.
6、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10min,加入30μL RNase Free的水中.
7、电泳检测.

逆转录
逆转录(reverse transcription)是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。此过程中,核酸合成与转录(DNA到RNA)过程与遗传信息的流动方向(RNA到DNA)相反,故称为逆转录。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一,需逆转录酶的催化。 逆转录过程的揭示是分子生物学研究中的重大发现,是对中心法则的重要修正和补充。人们通过体外模拟该过程,以样本中提取的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成出互补的cDNA,构建cDNA文库,并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。

实验步骤:
一、总RNA的提取
见“总RNA的提取”相关内容。

二、cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1. 在0.5 ml微量离心管中,加入总RNA 1-5 μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,轻轻混匀、离心;
2.70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min;
3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5 min;
4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;
5. 于70℃加热15 min以终止反应;
6.将管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。

三、PCR

1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;
2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;
3.设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照;
4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;
5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。