实验服务

实验委托服务
    绿藻公司可以帮助客户完善科研实验,满足客户提高科研能力的需求。现与国内多家知名的技术服务企业进行科研合作与交流。在整个实验流程上,专家配合客户监测实验流程,审查实验数据(QC),以提高实验效率,并确保试验结果的专业性,科学性。流程包括实验设计支持、试验流程监控、实验数据审查、实验结果分析。

蛋白分析
细胞蛋白提取
细胞总蛋白提取
(1)用冷PBS洗细胞三次,并吸出全部PBS。
(2)根据细胞量的多少,加入200-400ul RIPA buffer,RIPA buffer 中加入PMSF 10UL P 1UL L2.5UL 且在RIPA buffer 中刮掉细胞。
(3)将细胞溶液吸入Eppendorf管中,冰上静置1h
(4)超声3次,每次5s
(5)4℃ 16000g 离心15min
(6)取上清,进行下一步的蛋白浓度测定。
注(所有步骤要在冰上进行)

组织蛋白提取

组织中总蛋白的提取:
1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 μ 单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
(3) 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:
由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:
1、将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。
2、弃上清,加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、用枪洗干上清后,加100 μ 裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min,取上清即为蛋白。留取小量蛋白侧浓度。最好马上用上样缓冲液和蛋白混合变性,分装于小管里,不能反复解冻,容易导致蛋白降解。

蛋白定量
蛋白定量即蛋白质定量,蛋白质定量根据其目的看分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的“个别定量法”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功,或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存,需对细胞裂解液进行蛋白定量;为了判定蛋白的产量,需对纯化好的蛋白进行定量;为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记,同样需首先对蛋白样品进行定量,以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

ELISA
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

有几种分类方法:
夹心法
夹心法常用于检测大分子抗原,一般之操作步骤为:
1. 将具有专一性之抗体固著(coating)于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
2. 加入待测检体,检体中若含有待测之抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
3. 洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一之一次抗体,与待测抗原进行键结
4. 洗去多余未键结一次抗体,加入带有酵素之二次抗体,与一次抗体键结
5. 洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果
间接法
间接法常用于检测抗体,一般之操作步骤为:
1. 将已知之抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余之抗原。
2. 加入待测检体,检体中若含有待测之一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。
3. 洗去多余待测检体,加入带有酵素之二次抗体,与待测之一次抗体键结。
4. 洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,藉仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
竞争法
1. 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:
2. 将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
3. 加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
4. 加入带有酵素之抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。
5. 洗去检体与带有酵素之抗原,加入酵素受质使酵素呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少,显色也就越浅。
当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA。


      

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